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国外非洲猪瘟病毒疫苗的研究进展与展望

时间:2019-07-26 15:47来源:未知 作者:admin 点击:

 

摘要:非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒科的一种大型DNA病毒引起的一种复杂的猪疾病。该病表现出多种临床症状,急性型的病死率高达100%。ASF目前存在于非洲和欧洲,它以不同的方式循环传播,造成高度的社会经济影响。在大多数受灾地区,由于缺乏疫苗,控制措施在某种程度上并不有效。提供有效和安全的ASFV疫苗将支持和执行控制-根除战略。因此,合理开发保护性非洲猪瘟疫苗工作是当务之急。一些因素阻碍了疫苗的发展,包括ASF病毒粒子的复杂性和由其基因组编码的大量蛋白质。许多这样的病毒蛋白质抑制宿主的免疫系统,从而促进病毒复制和持续存在。我们回顾了以前的工作,目的是了解ASFV和宿主之间的相互作用,包括保护性免疫机制和疫苗开发方法。这些包括减毒活疫苗和基于DNA、蛋白质或病毒载体的“亚单位”疫苗。从短期到中期来看,减毒活疫苗是最有前景和最佳定位的候选疫苗。评估了差距和未来的研究方向。

 

关键词:非洲猪瘟;疫苗;免疫学;疫苗空白

 
 

简介

 


   非洲猪瘟病毒(ASFV)是引起非洲猪瘟(ASF)的一种重要疾病,对各种品种和年龄的野猪和家猪均有影响。在家猪和野猪中,ASF与许多临床表现相关,包括高死亡率的特急性型或急性型[1-3]。亚急性型,其死亡率相比降低30%至70%,亚临床型或慢性型可能导致非常低的死亡率[4]。在非洲,包括疣猪和野猪在内的野生动物中,长期带毒,但没有明显临床症状。在撒哈拉以南非洲的一些地区,这些哺乳动物,连同无脊椎动物钝缘蜱都可以作为ASFV天然宿主,作为家猪感染ASFV的永久来源。ASFV通过未感染的猪群(家养或野生)与受感染动物的血液、排泄物、分泌物、肉或尸体直接接触或与受感染产品间接接触时传播。因为它对养猪业产生了巨大的卫生和社会经济影响,所以ASF的通知是强制性的,其中包括禁止活动物和猪产品的国际贸易。

 

ASFV是非洲猪瘟病毒科家族的独特成员。其基因组是双链DNA,病毒有一个特征性的二十面体外壳,组装在一个内膜上并围绕着一个核蛋白核心,外膜以病毒芽的方式从细胞质膜中分离出来[5-7]。细胞内成熟和细胞外包膜形式的病毒具有传染性[8,9]。根据分离株基因组的特异性不同,DNA基因组的长度也存在差异,大约在170~193kbp之间。因此编码了150到167个开放阅读框(ORFs) [10-14],明确了ASFV粒子的54个结构蛋白和100多个感染蛋白[15]。在分子基因分型的基础上,迄今为止已描述了23种不同的ASFV基因型。所有基因型都存在于撒哈拉以南非洲,而只有基因型I和基因型II在非洲以外传播。ASFV基因型I在1957年和1960年传播到伊比利亚半岛,后来侵入到其他欧洲国家、加勒比和巴西,仍留在撒丁岛。基因型II在2007年从东非传播到高加索地区,然后在俄罗斯联邦和一些东欧国家迅速广泛传播。

 

ASF流行病学是复杂的,取决于病毒传播的特点、存在野生宿主、家养宿主和感染宿主、以及环境、社会和文化因素。在某些地区多年后,观察到猪的死亡率随着时间的推移而下降,变成亚急性型、慢性型或亚临床型的疾病,引起了中毒性和低毒性的病毒分离株的出现。这些不同的临床形式可能难以识别,并可能持续性的存活的在猪身上,为感染提供了潜在的贮存器。亚急性型感染后的幸存下来的猪被证明从口咽中释放病毒至少70天[16-18]。病毒也可以在感染后180天内从猪组织中分离出来[19–22]。因此,受污染、未煮熟的猪肉喂给猪以及受感染动物的活动是病毒传播的常见途径。

 

自1978年以来,ASF已在28个撒哈拉以南非洲国家和意大利撒丁岛传播[23,24]。继撒哈拉以南国家的流行病增加之后,2007年,ASFV的传播远远超出了其历史范围,首先蔓延到格鲁吉亚[25,26],现在报告在高加索地区、西北和中俄联邦、白俄罗斯、摩尔多瓦和一些东欧国家(立陶宛、波兰、爱沙尼亚、拉脱维亚、捷克共和国和罗马尼亚)。非洲或欧洲尚未实现对ASF的有效控制,对全球养猪业构成严重威胁。

 

目前还没有针对ASF的疫苗。预防、控制和根除措施主要基于通过有效的实验室诊断及早发现和实施严格的卫生措施[27]。如果可行的话,疫苗接种以控制牲畜中的病毒感染通常被认为是最具成本效益的措施。这些事实,加上欧洲大陆ASF的重新出现,增加了开发抗ASF疫苗作为一种额外控制工具的兴趣。提供安全有效的ASF疫苗将改善ASF疾病控制和根除计划,从而减少流行地区的经济损失。因此,为合理开发保护性ASF疫苗而开展的工作是优先事项。这篇综述描述了以前和现在为ASFV开发安全有效的疫苗的策略。并对未来前景进行了评估。

 
 

免疫反应

 

了解ASFV保护性免疫的复杂性是研制疫苗的关键问题。然而,这方面仍然是很差的。尽管如此,很明显,从感染中恢复的猪对一些ASFV分离株具有抵抗力,这表明这些动物可以产生保护性免疫应答[28-37]。然而,ASFV的复杂性,其编码超过160种不同的多肽,其中许多善于逃避免疫系统不同方面 [38],加上迄今所鉴定的病毒分离株的变异性,使这项任务变得非常复杂。

 

通过组织培养适应获得减毒的ASF病毒,对亲本毒性病毒具有较强的保护作用,但未对异源病毒提供保护,包括对在地理位置和时间上接近的ASFV分离株的保护作用[31,39]。类似地,几项研究表明,在感染了毒性较低的分离株存活下来的动物可以免受相关毒性病毒的攻击[28,40,41]。对不同基因型的交叉保护程度的研究很少,尽管有报告称某些基因型之间存在交叉保护[36,42-45]。目前,对交叉保护起重要作用的病毒抗原尚未完全鉴定出来,尽管病毒CD2v样蛋白被认为是一种候选蛋白[42,45–47]。

 

在寻找免疫相关的保护时遇到了相当大的困难。然而,保护性免疫反应包括细胞免疫和血清学免疫[32,33,35,37,48,49]。一些发现,如缺乏完全中和抗体,也仍然存在争议[50]。不管怎样,关于抗体介导免疫在保护中的某些作用的证据已经获得。因此,被动转移来自ASFV感染和恢复猪的血清,并通过延迟ASF临床症状的出现和降低病毒血症的水平,可以部分保护猪免受同源(亲本)ASFV的感染和感染的潜在致命后果[51–55]

 

多种体内和体外研究表明,抗体可能通过补体介导的细胞溶解或抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)等其他机制发挥保护作用[37,50,56–61]。在血清中存在血液吸附(HAD)抑制抗体的能力与其在体外抑制ASFV感染和在体内部分抵抗ASFV的能力之间建立了有趣的相关性[42,62]。

 

证据还表明,NK细胞[63]和特异性T细胞的应答在保护中的关键作用[33,35,63]。以自然减毒的ASFV分离物NHVNon Haemadsorbing Portugal 68(NHP68))从实验感染中恢复的猪为实验模型,观察到CD8-T细胞亚群对细胞毒活性导致的病毒消除的关键保护作用[33]。CD8+细胞群的抗体缺失使自然减毒菌株OURT88/3诱导的保护失效,证明了该细胞亚群在保护中的重要作用[35]。总之,现有证据表明免疫保护涉及抗体介导和细胞介导的机制。

 
 

参与免疫逃避和毒性的蛋白质

 

疫苗开发需要更好地了解病毒与宿主的相互作用。识别宿主细胞受体和与之相互作用的病毒蛋白有助于确定合理的疫苗方法,提高对克服抑制病毒复制的保护性宿主屏障的病毒机制的认识,以及参与保护宿主免疫机制。

 

ASFV靶细胞主要是巨噬细胞。这些细胞在激活和协调对病毒感染的免疫反应方面具有极其重要的作用[64,65]。ASFV使用许多策略来规避宿主的防御系统,包括先天和内在的免疫机制,如I型干扰素(IFN)反应、凋亡、炎症以及在ASFV感染期间特异性靶基因的激活[66,67]。识别介导这一过程的关键基因及其相应蛋白,对于理解病毒与宿主的相互作用具有重要意义,是设计有效减毒活疫苗的基础。

 

在鉴定这种病毒的“宿主逃避”基因方面已经取得了一些进展。例如,非必需的A238Lp,通过抑制宿主转录因子来抑制宿主免疫应答基因的转录激活。已知有几种病毒蛋白质在感染早期调节和抑制程序性细胞死亡途径。其中包括非必需蛋白A179Lp、BCL-2家族、A224Lp、凋亡抑制剂(IAP)家族和C型凝集素EP153Rp,这使得病毒复制和后代病毒的产生得以继续。相比之下,其他蛋白质,如必需结构蛋白p54/E183Lp,可能通过在感染后期诱导细胞凋亡来调节病毒颗粒的产生和释放机制。DP71LP蛋白招募蛋白磷酸酶1去磷酸化翻译起始因子eIF2并恢复整体蛋白合成。一些蛋白质参与抑制干扰素IFN的诱导,包括由多基因家族(MGF)360和505基因以及I329L、K205R和A276R基因编码的蛋白质[67–84]。I329Lp蛋白的特点是定位于宿主细胞表面膜的糖蛋白,是第一个通过Toll样受体3(TLR3)信号通路抑制IFN反应的ASFV蛋白[71]。此外,I329Lp还抑制TLR4信号。k205rp蛋白在细胞质中定位并抑制IFN-β的激活。A276Rp蛋白也被确定为IFN-β激活的抑制剂,而且似乎不针对IRF-7。由于抑制了干扰素-β,数百个干扰素刺激基因的表达受到抑制。它们在激活受感染细胞和旁观者细胞的抗病毒状态和激活宿主免疫反应方面有广泛的功能。D96Rp(也称为UK)蛋白也是一种潜在的免疫逃避基因,尽管其作用机制尚不清楚[85]。其他调节蛋白包括存在于细胞外病毒表面并抑制淋巴细胞活化的血红素凝集素CD2v/E402Rp蛋白[86-88]。这些基因是开发一种减毒基因缺失突变病毒疫苗的候选靶点

 

最后,一些必需的ASFV蛋白被鉴定出来,包括ASFV-Toposoimerase II [89–91]、组蛋白样蛋白[92]和ASFV-E2泛素缀合酶,利用表达这些基本蛋白的辅助细胞系,产生有效的单周期突变病毒疫苗开辟了新的途径。蓝舌病[93–95]和非洲马瘟[96,97]也有类似的治疗方法。基因缺失,减毒病毒和复制缺陷型病毒的优点是通过主要组织相容性复合物(MHC)I和II类分别向CD8和CD4 T细胞呈现几乎全部的病毒库,从而刺激细胞和血清学免疫。

 
 

病毒蛋白对诱导保护性抗体反应

 

病毒蛋白的鉴定可能是抗体介导中和或消除的靶点,还有待进一步研究。细胞内成熟和细胞外包膜的感染性病毒粒子表面上的病毒蛋白以及受感染细胞的表面,被认为是抗体介导保护的重要蛋白质(见图一)。病毒中和靶点已经确定,包括p72/B646Lp,p54/E183Lp和p30/CP204Lp。p72/B646Lp和P54/E183LP抗体抑制病毒与结合细胞,而p30/CP204Lp对病毒内化有抑制作用。其他存在于细胞内成熟或细胞外包膜的病毒颗粒表面的病毒粒子蛋白,可能是通过中和靶点防止病毒进入或传播,其中包括CD2v/EP402R蛋白,p12,/O61Rp, D117L蛋白[42,50,58,98-100]。

 

研究猪巨噬细胞上细胞受体的特性,以便识别病毒和宿主分子参与病毒进入,作为抑制这一过程的目标具有重要意义。这些分子也可能包括细胞内宿主蛋白。例如,参与病毒内涵体释放到细胞质或在细胞质内转运的重要的细胞蛋白[101,102]。CD2v/EP402Rp与细胞适配器AP-1的相互作用可能参与病毒颗粒的运动,从而对毒力和免疫逃逸产生影响[101]。

 

 

 

图1.非洲猪瘟病毒(ASFV)结构。显示了细胞外ASFV粒子通过细胞质膜的电子显微照片。该粒子大(约200纳米),包含50多种蛋白质。图上有几层。核蛋白核(NU)被核壳(cs)和内包膜(IE)包围,内包膜上组装有二十面体衣壳(CA)。这种细胞内成熟颗粒在细胞质病毒工厂中组装。细胞外病毒颗粒通过细胞质膜获得一个额外的外包膜(OE)。OE含有ASFV蛋白、CD2v/EP402Rp、p12/O61Rp和指定为p24的细胞蛋白;CA含有主要蛋白p72/b646lp和e120rp、b438lp;IE含有p17/d17lp、p54/e183lp、E248Rp和p12/O61Rp;CS含有多蛋白pp220/CP2475Lp(p150、p37)的裂解产物p34,p14)和pp62/cp530rp(p35,p15)和S273Rp;NU包含p10/K78Rp,104Lp,启动感染所需的蛋白质和酶,包括病毒RNA聚合酶和病毒基因组。

 

抑制病毒传播的抗体也很有用。对病毒进入机制的研究表明,ASFV使用巨胞饮[103]和其他机制,包括网格蛋白介导的内吞作用进入猪巨噬细胞[104]。

 

对保护性免疫的潜在保护性血清学决定因素的合理鉴定(通过筛选一个病毒表达库,用一个来自感染致命的病毒株存活下来的家猪的多克隆抗血清)确定了14个血清学免疫决定因素,包括病毒蛋白B602Lp、C44Lp、CP312Rp、E183Lp、K145Rp和K205Rp,以及结构蛋白A104Rp、p10/K78Rp、p30/CP204Lp、p54/E183Lp、p72/B646Lp和非结构蛋白核糖核苷酸还原酶(F334Lp、F778Rp)、DNA连接酶(NP419Lp)和胸苷激酶(K169Rp)[105]。

 
 

病毒蛋白对诱导T细胞介导免疫的作用

 

有强有力的证据表明特定的CD8+T细胞在保护中起着重要作用[35106]。通过对猪的DNA免疫,在缺乏特异性抗体的情况下,显示出对ASFV的部分保护,与特异性CD8+T细胞对CD2v(血凝素)的诱导相关[107108]。用质粒文库进行DNA疫苗接种,鉴定出具有保护潜能的多细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位[37]。需要进一步的研究来确定相关抗原表位的特征,以及在杂交猪群体中由MHC肽表达的变异引起的并发症。

 

在G1340lp蛋白[109]和ASFV p30/CP204Lp和P72/B646lp结构蛋白[110,111]中已经描述过CTL决定因子,但它们在保护方面的作用尚未得到证实。由于T细胞群的异质性,识别与保护相关的ASFV CTL表位是一个复杂的问题[34]。

 

除了CD8 T细胞外,其他T细胞亚群可能在保护中起到重要作用[37]。进一步了解T细胞以及NK和其他来自先天免疫系统的细胞的作用,将有助于将来制定最佳的亚单位疫苗配方。

 
 

疫苗的研制方法

 

自20世纪60年代以来,已对ASFV疫苗的开发进行了研究,所采用的方法包括灭活病毒、重组蛋白/肽、用于抗原传递的病毒载体和减毒活疫苗。到目前为止,这些实验方法都没有被提出来评估它们的商业生产潜力。

 

6.1. 灭活候选疫苗

 

迄今为止,即使在有佐剂的情况下,ASFV的灭活制剂也没有给予保护,如果细胞免疫对保护是必要的,这并不完全令人惊讶。此外,还观察到抗体介导的感染增强的可能性[112-116]。病毒颗粒的复杂性,在数层中含有50多种蛋白质,并且有两种感染形式,一种是细胞内成熟的,另一种是细胞外形式, 由于在原发性感染中很难实现有效的病毒中和,可能还会导致这种保护失效。

 

6.2. 亚单位疫苗方法

 

ASFV编码高达167种蛋白质,因此很难选择能诱导保护作用的候选抗原,使其与亚单位疫苗结合。如前所述,几种ASFV蛋白被报道为病毒中和的靶点,并对这些蛋白诱导保护的可能性进行了测试。

 

虽然用杆状病毒表达p54和p30的猪联合免疫对E75[98]具有显著的抗致死作用,但p54+p30+p72杆状病毒表达蛋白的组合对致病性马拉维分离株[100]没有抗致死作用。这些相互矛盾的结果可能部分原因是使用的病毒株,尽管最近对编码p54和p30的DNA疫苗的研究没有诱导中和抗体或显示出对E75致命感染的任何保护作用[117]。然而,由于蛋白质免疫方案与DNA免疫方案的性质非常不同,这些结果很难进行比较。在另一项研究中,当CD2v/EP402R基因在杆状病毒系统中表达时,可以在一定程度上诱导机体抵抗病毒的侵袭。这与抗体诱导的抑制血液吸附(HAD)和暂时抑制感染抗体的有关[62]。最近的证据表明,CD2v/EP402R和/或C型凝集素/EP153R蛋白可能对防止ASFV感染很重要[42]。

 

DNA疫苗也被用来识别潜在的保护性抗原。用p30/CP204L和P54/E183l基因融合的猪免疫,用针对猪白细胞抗原II的特异性抗体的单链可变片段基因,诱导ASFV特异性T细胞。然而,既未中和抗体,也未对毒性挑战的保护报告 [107]。HA细胞外结构域(CD2v/EP402R)的基因片段与LP30/CP204L和p54/E183L基因融合,可增强猪的体液和细胞反应,而不提供保护。然而,这三个ASFV基因(CD2v/EP402R、p54/E183L和p30/CP204L)与泛素基因的融合,诱导了强烈的CTL反应,并在没有特定抗体的情况下给予部分保护。这种保护作用与HA(CD2V/EP402R)特异性CD8+T细胞的增殖相关[117]。用含有其他几种与泛素融合的病毒ORFs的DNA表达文库进行进一步免疫,也可以部分保护其免受毒力攻击[108]。同样,这种保护与ASFV特异性T细胞的诱导和检测抗体的缺失有关,强调了T细胞应答在保护中的作用,揭示了具有潜在保护能力的多种ASFV抗原的存在。尽管这些策略在未来可能对分离免疫机制和参与保护的ASFV抗原具有实用性,但目前它们远不能提供在该领域有用的保护水平。

 

利用特异性ASFV重组蛋白和DNA的组合进行引物促进策略,尽管诱导了强大的免疫反应,但没有观察到对亚美尼亚菌株的攻击的保护 [118]。表1总结了亚单位蛋白或DNA疫苗的当前开发方法。

 

表1.亚单位蛋白或DNA疫苗的开发方法

 

用表达单个ASFV蛋白的重组腺病毒池对猪进行免疫,并用相同的载体[119]或表达相同抗原的重组改良牛痘-安卡拉株(MVA)进行增强免疫[120],尽管没有受到ASFV的攻击,但也也能诱导强烈的细胞和抗体反应[119,120]。

 

为了确定潜在亚单位疫苗中包含的抗原和疫苗接种后触发的最佳免疫机制,以便对ASFV提供的可靠的保护,需要进一步的工作。还需要确定猪免疫的最佳输送系统。

 

6.3.减毒活疫苗(LAV)

6.3.1.从有毒和自然产生的低毒ASFV分离株中获得的LAV

 

由于自然产生的毒性毒株的减少,而在LAV领域的使用仅限于葡萄牙和西班牙在1960年代初的广泛经验[121]。当时,大量的动物在野外接种了LAV,其中动物暴露于多重感染,并通过不同途径再次感染循环的野外菌株病毒,可能包括接触受感染的软蜱。在这些条件下接种疫苗导致出现慢性ASF[122]。在西班牙的野外实验中,一些动物出现了慢性临床症状。这些疫苗不再使用,主要是由于其固有的传染性引起的安全问题[123]。

 

其他实验策略包括用自然减毒的ASFV菌株OURT88/3或NH/P68对猪进行免疫。免疫猪被保护以抵抗相关毒株攻击[35,40,42,63],并且部分交叉保护已显示抵抗异源病毒[42–46]。保护水平从66%到100%不等,取决于猪和病毒的攻击,以及输送途径和给药剂量[36,40,43,44,89]。如亚单位疫苗所述,特异性抗体[53]和特异性CD8+T细胞[35]似乎在LAV提供的保护中起着关键作用。OURT88/3分离株对来自不同基因型的毒力分离株的挑战所诱导的交叉保护与这些分离株特异性刺激免疫猪产生IFNy的淋巴细胞的能力相关[36]。尽管特异性T细胞应答的诱导与保护之间存在相关性[36,37108],但这还远未被证实,其他免疫机制正在研究以确定保护关键参与者。然而,迄今为止,使用这些自然减毒的ASFV菌株作为疫苗的尝试已经证明了一些副作用,至少是某些剂量,因为大部分接种过疫苗的猪在接种后出现了不可接受的反应,包括肺炎、运动失调。ES、坏死病灶、流产和死亡。在最好的情况下,除了短暂发热和低病毒血症外,猪没有显示出明显的临床症状,这与一些接种过疫苗的猪的鼻低鼻流涎相符[43,44,63]。

 

6.3.2.从毒力病毒获得的重组LAV

 

含有胸腺嘧啶激酶(TK)基因等特定基因缺失的重组ASFV可产生非致病性病毒[45,81124]。此外,参与逃避免疫反应的基因、NL(或称为DP71L)基因、多基因家族360和505(MGF 360/505)的多个成员、或参与病毒复制或形态发生的基因和9GL(B119L)基因的缺失,导致了毒性强的ASFV分离株的衰减。并诱导对毒性亲本病毒攻击的保护性免疫反应,但具有不同程度的残余毒性[125–128]。然而,基因缺失对ASFV衰减和保护诱导的影响可能依赖于菌株,在某些情况下,被删除的病毒表现出与亲本病毒难以区分的毒力表型。例如,从毒株中删除NL(DP71L)基因可完全减弱动物体内的欧洲E70菌株,但对两个非洲ASFV菌株没有影响[127–129]。此外,由于胸腺嘧啶激酶(TK)基因的缺失,马拉维和格鲁吉亚的ASFV菌株均被减弱,但只有TK缺失的马拉维病毒能够诱导接种动物的保护性免疫反应[124]。

 

最近的研究表明,多种基因突变体在ASFV中可以不同地影响病毒的免疫原性。MGF360和505的6个成员与9GL基因的多重缺失产生了一种安全性提高的减毒Georgia ASFV菌株,但当受到毒性亲本病毒的攻击时,不能给动物提供保护[130]。相比之下,通过删除9GL和DP96R/UK毒力因子修饰的毒力Georgia分离株显示出比单独删除9GL更高的安全性和保护性[131]。这些结果清楚地表明,连续删除第二个毒力因子可能产生更安全的重组减毒活ASFV疫苗,从而为未来的工作打开了希望。

 

用CD2v/EP402R(HA)基因分离出的BA71基因型I在用同源(亲本)毒力ASFV BA71株和异源毒力基因型I E75和基因型II Georgia07 ASFV毒株攻击的猪 [45]产生保护作用[34]。结合目前所描述的一些不同的突变,可能会产生一种具有潜在领域应用的疫苗原型。

 

6.3.3.从减毒病毒获得的重组LAV

 

通过删除几个基因来提高减毒菌株(OURT88/3或NH/P68)安全性的几种策略提供了不同的结果。DP71L和DP96R(与毒力和临床症状有关)或A276R(一种干扰素抑制剂)等基因的缺失降低了减毒病毒抵御攻击的能力[132]。相比之下,这些突变体中的一些表现出了很好的保护(60-100%)以抵抗与2007年亚美尼亚毒株的攻击。然而,与以前的研究一致,候选疫苗在大多数接种的猪中诱导(低)病毒血症和副作用,如关节炎和坏死病灶[43,44],这将阻止它们的商业用途。主要的抗病毒反应,I型干扰素,是病毒衰减和诱导保护的关键。然而,重要的是要达到平衡,使有效的病毒复制发生,以诱导有效的免疫反应,但避免临床症状[44,130,131]。

 

6.3.4. 细胞系用于LAV的产生

 

原发性猪巨噬细胞和单核细胞培养系统被在实验室用于ASFV进行生物学和免疫学研究。然而,因为批量的变异和从动物供体获得细胞的费力而昂贵的方法,初级细胞不太可能用于疫苗的生产。这些问题在一定程度上被一些ASFV分离株的适应性所克服,它们可以在不同的稳定猴细胞系(如Vero或MS细胞)中生长,这些细胞系通常用于生物研究、生产和适应病毒的纯化[133-135]。然而,对ASF病毒的适应总是导致基因组的变化,从而减少猪的病毒复制,从而无法实现保护[136]。与此相关的是,到目前为止已经开发出五种来源于单核细胞的猪细胞系:ZMAC、IPAM WT、IPAM-CD163、WSL和CD2+[137–141]。此外,COS细胞系在维持ASF病毒的“体外”复制方面表现出很高的效率,且几乎没有明显的适应性[135142143]。在COS细胞中产生的BA71CD2基因修饰的LAV产生了一种有效的疫苗,能够提供同源和异源保护。COS细胞系成功用于LAV的产生,没有显著的基因组变化[45]。然而,一些基于NH/P68菌株的“体内”实验研究表明,COS细胞中产生的LAV不能维持提供保护的能力[144]。因此,需要对COS细胞在疫苗生产中的潜在用途进行进一步的评估研究。此外,到目前为止,还没有研究确定由细胞系如WSL和COS-1产生的ASFV菌株的行为。

 
 

DIVA试验的发展

 

疫苗的应用取决于附带的歧视性试验(DIVA试验)的可用性,该试验允许在接种动物和感染动物之间进行区分。为了确保对接种疫苗的猪的接种活动及其对疾病演变的影响进行适当的监测,疫苗将需要一个阳性和阴性标记,区分接种疫苗的动物和自然感染的动物。因此,应将DIVA试验与疫苗开发同时考虑,并适应接种养殖(注射给药)和自由放养的猪群(口服给药)的情况。

 

这些试验对于亚单位疫苗或LAV的设计可能相对容易。后者可能是基于那些被删除的基因,以提供一个基于阴性标记的DIVA试验。阴性标记物(如毒力或IFN抑制剂基因)首先需要评估在未接种的、受感染的动物(在接种的动物中不存在)中抗体的诱导。由于被操纵菌株(BGal、BGus等)的基因组中存在标记物,因此可以使用阳性选择,这有助于使用分子或血清学方法区分疫苗和自然菌株。

 

 
 

最短时间内可能获得的ASFV候选疫苗

 

从目前可用的疫苗开发数据来看,在短期内LAV似乎是最有希望的候选者。到目前为止, 许多LAV(高达100%)证明了坚实的保护,通过进行多个基因缺失以及它们提供可靠的交叉保护的潜力,提高了安全性,支持了对它们在中期内进行实地实施的潜力的乐观态度。表2基于现有数据/知识总结了最有前景的疫苗开发的LAV候选疫苗。尽管他们在实验上取得了成功,但仍需要进一步的研究来证实他们在长期对照实验中的安全性、DIVA能力和有效性;这是提供最佳LAV的必要条件。

 

为开发ASFV亚单位疫苗而进行的研究表明,对其迅速商业化实施更为谨慎。与它们固有的安全性和DIVA潜能相比,抗ASFV攻击实验的防护水平较差。一项持续的研究工作集中在抗原发现和更好地理解ASFV保护的机制上,从长远来看应该是成功的。

 

表2.ASFV LAV的发展前景广阔

Att=减弱,Vir=毒性。细胞系统:猪血单核细胞/巨噬细胞(PBM)、猪骨髓细胞(BM)、猴肾组织源性细胞(COS)或猪肺泡巨噬细胞(PAM)

 
 

专家评论

 

ASFV疫苗开发的进展需要进一步研究病毒生物学和各级病毒与宿主的相互作用。研究空白包括转录组分析,以识别在复制周期的不同阶段转录的病毒基因,以及更好地了解病毒结构蛋白,尤其是病毒表面的结构蛋白。此外,更好地了解病毒进入机制,包括猪巨噬细胞上的细胞受体,将确定疫苗开发的目标。需要进一步定义ASFV蛋白的功能,特别是抑制宿主防御的功能,以优化LAV的发育。

 

目前对ASFV免疫保护机制的研究还很缺乏。有证据表明,保护抗ASFV所需的适应性免疫反应涉及血清免疫和细胞免疫。宿主免疫和/或伴随的共同病原体感染状态似乎影响ASFV毒力。研究包括野猪和疣猪在内的自然宿主抵抗ASFV疾病的机制可能有助于确定参与保护的关键因素,从而开发ASFV疫苗。然而,我们应该记住,这些非洲野猪与家猪和野猪属于不同的物种。这些非洲野生动物可用于实验,因此不能适应圈养条件,动物园也不愿意为动物实验提供个体。因此,建立用于疫苗研究的疣猪和野猪的集合应该是调查野生非洲猪对ASFV自然保护的机制和过程的一个有用的初步步骤。

 

由于这些限制,一些专家认为应将工作重点放在猪身上作为感兴趣的目标物种。初步的体外试验是绝对必要的(例如,在猪巨噬细胞中持续复制LAV的能力)。在体外和体内识别免疫保护的相关因素将有助于评估对攻击的诱导保护以及减少不必要的ASFV疼痛挑战。虽然疫苗注册不需要,但对保护相关因素的了解也有助于监测疫苗的效力并降低疫苗测试的成本。

 

对于野猪种群来说,潜在的候选疫苗需要口服后具有免疫原性,这可能需要疫苗中更高的病毒滴度。此外,口服疫苗需要在外部环境中保持稳定,以避免在低温和高温、阳光和其他环境因素下失去效力。另一个需要考虑的因素是,诱饵的设计应允许所有年龄和不同季节的动物吸收和吸引力。为了制定可行的口服免疫计划,需要一种给药装置以诱饵形式,它已成功地开展了野猪对典型猪瘟的口服疫苗接种运动[145,146]。

 

9.1. LAV的差距和未来方向

 

尽管最近在使用LAV方面取得了成功,但仍有一些重要的差距和不确定性需要考虑。LAV已经被证明可以提供坚实的保护(高达100%的存活率),以抵御ASFV的实验挑战。然而,ASF 的LAV的安全性至关重要。对于疫苗注册,安全性和免疫原性必须建立在一系列的,应研究重复给药和过量给药的剂量和安全性。

 

在体外培养和猪体内传代过程中,建立LAV的遗传稳定性也是必要的。应建立野生型挑战病毒疫苗接种实验中缺乏重组的机制。在一个LAV候选中多次删除应将这种可能性降至最低。由于资源有限,完成疫苗注册所需的所有实验的成本非常昂贵,建立一条评估LAV候选的渠道将非常重要,这将使及早选择最佳候选进行进一步评估。理想情况下,这包括细胞培养阶段的一些选择。因此,识别体外相关发病机理和又到保护能力是非常重要的。

 

其他缺口与要删除的靶向毒力基因的选择有关。然而,由于基因缺失对ASFV衰减和保护的影响可能与菌株依赖性有关,因此并不总是清楚哪些致病基因是目标基因。所以,可能需要对不同基因型的基因缺失病毒进行检测,以获得对在不同区域传播的分离株提供保护的菌株。需要进一步的工作来优化可被删除的基因组合,以产生符合注册所需安全标准和诱导良好保护水平的LAV。

 

另一个尚未解决的重要问题是获得许可的细胞株可用于生产疫苗的LAV。一些成功的使用候选建立的细胞株已经报告,但需要更多的工作来优化商业生产系统。

 

9.2. 亚单位疫苗的差距及未来发展方向

 

候选亚单位疫苗也需要进一步的工作。一些ASFV蛋白与保护有关,但没有一种特定的病毒蛋白被证明足以在猪身上提供完全强大的保护性免疫。因此,很可能会发现出具有保护潜力的其他抗原,并确定一小部分能够诱导高水平保护的抗原。先前的研究[105]表明灭活病毒不能防止感染。此外,需要优化的传递/载体系统来诱导良好水平的免疫反应。几种免疫策略和传递/载体系统已被用于用各种不同的ASFV抗原对猪进行免疫。这些实验的结果很难比较和解释,因为抗原或传递/载体系统可能不是诱导保护性免疫反应的最佳选择。还需要进一步的工作来确定保护性抗原,优化疫苗接种的输送系统和策略,以诱导保护性反应。最终,还需要确定可在商业领域应用的系统。应该研究能够传递几种抗原/基因的病毒载体。最后,应牢记诱导“增强”抗体反应的可能性。

 

9.3. 疫苗候选评价方案

 

新疫苗的开发依赖于强大的临床前动物模型,以便选择那些进展到临床开发的候选疫苗。应根据《欧洲兽医免疫学立法指南》[http://www.ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=pages/regulation/general/general_content_000374.jsp&mid=WC0b01ac058002ddc5],的要求,制定试验条件下疫苗候选方案的设计。考虑到欧盟疫苗注册的关键要求,如目标物种(猪、野猪)、类别(幼/老动物、孕妇)、疫苗管理路线、动物福利用于活体实验、疫苗剂量(取决于拟定的疫苗接种时间表)、标准化临床数据收集和分析(技术、目标样本等)、感染途径、挑战剂量、使用的挑战病毒株、疫苗接种期和安全性研究(包括缺乏对毒力的恢复)和环境风险评估(病毒存活、建立和传播的能力以及对其他活生物体的致病性)。

 

所确定的差距主要围绕两个方面:(i)协调和标准化临床数据收集和分析;(ii)减少临床试验的规模、长度和成本。一个关键的缺陷仍然是缺乏可靠的“体外”相关的“体内”保护。因此,抗原或LAV成为真正的疫苗候选的唯一不可辩驳的证据来自其临床保护目标物种(猪和野猪)的潜力。这被认为是ASF疫苗开发进展中的主要挑战之一,因为除了猪之外,没有其他动物模型。使用LAV进行的安全性实验需要对大量动物进行长期的实验。在需要严格生物安全3级(BSL3)动物设施的猪身上,通过疫苗接种挑战实验来测试和选择疫苗。考虑到与疾病发展有关的中度到重度动物痛苦,以及在实验结束时屠宰所有动物的要求,这类程序不仅非常昂贵,而且在环境和道德上也很困难。根据欧洲法律,免疫兽医药物指南,在体内实验室试验之后,未来疫苗的有效性和安全性应通过实地试验进行评估。实地试验是评估候选疫苗风险效益的关键。它们的设计将取决于疫苗(DIVA疫苗、配方)的特性以及在不同病毒宿主情况下的感染(不同的毒力、不同的宿主密度、不同的毒血症持续时间和发生慢性感染的概率)。

 
 

结论

 

最近令人担忧的ASF在东欧的蔓延需要立即采取对策,开发疫苗是一项重要的优先事项,同时也是伴随一个额外的好工具,卫生控制措施。

 

在过去十年中取得了相当大的进展,从而开发出有潜力在短期/中期用作候选疫苗的ASF减毒菌株。然而,在LAV可用于商业开发之前,有许多重要问题需要澄清。用现有的候选LAV进行进一步的体内试验,以确认对相关野外分离株的安全性和有效性的可接受水平,这是一个强制性的步骤,确保安全性是其实是施执行的主要挑战。需要更多的研究来发展保护的体外相关性,以便于选择最有前景的疫苗候选,并减少动物挑战实验的数量。此外,对于LAV的生产,确定一个合适的细胞系是优先考虑的事情。

 

基于ASFV(亚单位疫苗)的个别决定因素开发高效疫苗也需要并行的研究工作。与LAV相比,亚单位疫苗具有无害的优点,但是,在保护性抗原发现和有效传递机制的研究方面,亚单位疫苗需要长期的努力。

 

为了在实地使用任何类型的疫苗,应同时进行DIVA试验。

 

原则上,可以为家猪和野猪设计相同的疫苗株。野生野猪的自然种群已经通过使用口服可口的诱饵来有效地接种疫苗来对抗其他传染病。然而,开发一种成功用于野猪的特定疫苗可能会对疫苗的接种途径、效力、安全性、在环境中的使用以及监测自然种群的免疫性带来额外的挑战。在这两种情况下,猪和野猪的疫苗都应以适应ASF日益增长的威胁为导向,直接对抗疫情。为此,应根据风险评估策略设计现场管理疫苗接种计划,以便根据非洲和东欧的不同流行病学情况有效地控制疾病,并减少在非洲和东欧引入ASF的威胁和可能去无病地区。

 

参考文献:略

 

文章来源:
作者:Marisa A , Ana D L T , Linda D , et al. 

标题:Approaches and Perspectives for Development of African Swine Fever Virus Vaccines

来源: [J]. Vaccines, 2017, 5(4):35

 

(责任编辑:admin)
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